杂志名称：MolecularTherapy
影响因子：8.
文献题目：HLSC-DerivedExtracellularVesiclesAttenuateLiverFibrosisandInflammationinaMurineModelofNon-alcoholicSteatohepatitis
译名：
第一作者：StefaniaBruno
通讯作者：GiovanniCamussi
作者单位：意大利都灵大学医学院
本实验所用产品：AAH-BLG-（可同时检测个人类蛋白的半定量玻璃芯片）
摘要细胞外小泡(EVS)是几乎所有类型的细胞都能释放的膜小泡。多项研究表明，干细胞衍生的细胞外小泡可以在体外和体内模仿细胞的生物学效应。我们最近证实，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)可以被人肝干细胞(HLSCs)治疗所抑制。本研究的目的是评估HLSCs释放的EVS是否影响免疫低下小鼠由不含蛋氨酸和胆碱的饮食诱导的NASH的进展。EV治疗在饮食2周后开始，每两周给药三种不同的剂量。光学成像评估的生物分布显示，在正常肝脏，尤其是纤维化的肝脏中优先蓄积。EV治疗显著改善了肝功能，并在形态学和分子水平上减少了肝纤维化和炎症的迹象。特别是，我们观察到，在NASH肝脏中上调的29个纤维化相关基因中，有28个被EV治疗显著下调。总之，HLSC来源的EVS在慢性肝病模型中显示出抗纤维化和抗炎的作用，导致肝功能的改善。
结果1.1人肝脏干细胞来源的细胞外囊泡的特性采用流式细胞术、WB和透射电镜对人肝脏干细胞来源的细胞外囊泡（EV-HLSCs）进行鉴别。
图1.EV-HLSC的特性采用基于多重微珠的流式细胞术检测EV-HLSC的表面特征。
用3种不同的EV-HLSC样品孵育39个染料标记抗体包被捕获小球。(A和B)捕获的EV-HLSCs用泛四肽APC标记(A)或CD29APC(B)检测抗体复染。该图显示了在三种不同EV-HLSC制剂的背景校正(从测量的EV-HLSC值减去中等控制值)之后所有珠群的中位数APC荧光值的量化。在评估的不同EV-HLSC制剂之间没有统计学意义的差异。(C)具有代表性的EV-HLSCs外体标记(CD63、CD9、CD81和Alix)的蛋白质印迹分析。(D)EV-HLSCs透射电镜的代表性显微照片。EV用NanoVan染色阴性(标尺，nm；放大，,×)。
1.2EV-HLSCs对NASH小鼠肝功能和形态学的改善作用为了评估EV-HLSCs对肝纤维化和炎症的潜在治疗能力，研究人员用蛋氨酸和胆碱缺乏的饮食(MCDD)喂养小鼠来诱导NASH。EVs注射能显著降低肝脏损伤和肝脏纤维化程度。
图2.EV-HLSCs对肝功能和形态学的影响
(A)在NASH小鼠中测试EV-HLSCs的实验设计示意图，显示了用MCCD喂养、EV-HLSC给药和牺牲的几周。(B)以单位/升表示的ALT水平作为肝细胞损伤的生物标志物在对照组(CTRL)和MCDD喂养4周的小鼠(NASH)和静脉注射不同剂量的EVS(每只小鼠注射1：5×EVs，n=9；剂量2：2.5×Evs/只，n=9；剂量3：每只小鼠注射2.5±EVS(n=8)，4周时处死。(C)对注射不同剂量EVS和单纯赋形剂(NASH)的MCDD-Feed小鼠进行组织学定量，并在4周处死10个视野横截面(原始放大倍率为×)的多相图像分析。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和肝纤维化的数据代表均值+标准差。方差分析采用Newman-Keuls多重比较检验。*P0.05，注射1和2剂量EV-HLSCs的NASH小鼠与单独注射赋形剂的NASH小鼠相比，差异有统计学意义(P0.05)。(D)经静脉注射的MCDD第4周小鼠肝脏组织学典型光镜照片。不同剂量的EV-HLSCs或单独使用载体(NASH)(原始放大倍率，×)。天狼星红染色显示NASH小鼠静脉周围有纤维化。红色染色代表胶原纤维，被认为是肝纤维化的标志。
1.3EV-HLSCs治疗下调NASH小鼠肝脏促纤维化和促炎基因对健康和NASH小鼠静脉注射标记的EVs，给药后评价各器官对EVs摄取情况，结果表明EVs在肝脏积聚最明显，在纤维化的肝脏中EVs显著积聚。这可能是由于NASH小鼠肝脏对EVs的吸收。
图3.EV-HLSC的生物分布
(A)MCDD喂养的小鼠解剖器官中荧光强度的定量，测量为EV-HLSC注射后3小时的平均辐射±SD(n=6)。(B)NASH和健康小鼠肝脏光学成像获得的代表性图像，在EV-HLSC或给药后3h采集。(C)对注射荧光EV-HLSCs的NASH和健康小鼠肝脏的荧光强度进行定量。**p0.01，NASH小鼠与健康对照组小鼠比较，t检验。
1.4EV-HLSCs治疗下调NASH小鼠肝脏促纤维化和促炎基因研究人员通过比较EVs治疗前后NASH小鼠的基因表达谱。聚类分析显示，EVs治疗能显著逆转NASH小鼠中促纤维化和促炎相关基因的表达，降低炎症细胞的浸润程度。
1.5EV-HLSC蛋白载体可能调节炎症用抗体芯片对EV-HLSC裂解液中的蛋白进行检测并进行富集分析，结果显示细胞因子和炎症反应、IL-10抗炎活性、PI3K途径和p53途径被显著富集。它们大多与炎症和干细胞来源的细胞外囊泡有关，通过调节促纤维化和促炎基因的表达水平，改善了实验性非酒精性脂肪肝炎小鼠的肝功能和形态。
图6.EV-HLSCs携带蛋白质的途径富集分析
(A)代表性条形图，显示EV-HLSCs携带的种蛋白质的主要途径，由基于抗体的蛋白质阵列鉴定。其中大部分与炎症和细胞因子途径有关。数据根据Z得分进行排序，并在表S2中报告。(B-E)条形图，显示参与炎症的主要富集途径中不同蛋白的荧光强度平均值(F.U.Mean)：(B)局部急性炎症反应蛋白；(C)IL10抗炎信号途径；(D)细胞因子和炎症反应途径；(E)炎症反应途径。带有FU均值定量和途径富集分析的完整蛋白质列表可在表S3中找到。
结论在本项研究中，作者用Raybiotech半定量抗体芯片检测人肝脏干细胞来源的细胞外囊泡个蛋白的表达水平。结果显示，EVs治疗能显著逆转NASH中促纤维化相关基因的表达，显著降低NASH的纤维化和促炎基因的表达水平，减少炎症细胞的浸润程度。通路富集分析表明结果，EVs分泌的蛋白主要富集在细胞因子和炎症反应、IL-10抗炎活性、PI3K途径和p53途径。
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