一、研究背景
胰腺癌是全世界最致命的恶性肿瘤之一，胰腺导管腺癌（PDAC）是最常见的类型。在最初的80％的PDAC患者中检测到远处转移，肝脏作为最常见的转移器官。PDAC肝转移的每种治疗方案有限，有利于高死亡率。这种缺陷很大程度上是由于肝转移的潜在机制的理解差。
关于转移的新发现证据表明，原发性肿瘤重塑了支持肿瘤生长的未来转移位点的微环境，其在远处器官中的细胞外基质（ECM）的重塑成分，是一种对转移至关重要的重转移性利基。可以激活粘附到纤维化ECM的肿瘤细胞以激活。免疫细胞部分重组ECM并最终将转移细胞募集到特定器官中。此外，在预转移性的Niche沉积中癌症相关的成纤维细胞（CAF）基质蛋白质，为肿瘤细胞到达提供有利的纤维化环境。尽管这对肝脏微环境调控有关肝脏微环境调控的研究，但肝脏纤维化微环境控制的分子机制仍然不清楚。外泌体是由所有细胞类型分泌的细胞外纳米型（30-nm）多态性囊泡，含有特异性蛋白质，脂质和遗传物质。肿瘤细胞利用这种细胞间通信来重编程靶细胞并触发相关的病理过程作为血管生成，免疫调节和转移。更多重要突然地，原发性肿瘤细胞和远端器官之间的细胞-细胞通信通过外泌体对肝癌细胞衍生自胃癌细胞的含有含有胃癌细胞的表皮生长因子受体的外皮生长因子受体递送至肝脏基质细胞并有利于类似地，肝脏微环境的发展类似地，同样，肺成纤维细胞摄取乳腺癌外泌体的摄取促进了它们的活化和纤连蛋白分泌。此外，原发性肿瘤衍生的外泌体小核RNA增强基质金属蛋白酶9和肺癌中的纤连蛋白表达，从而促进了预转移性的利基形成。
目前的文献表明，远处器官中的ECM重塑对于肿瘤转移至关重要，癌症衍生的外泌体可以在原发性肿瘤细胞和远处器官的ECM微环境之间调节沟通。然而，纤维化肝脏微环境下面的分子机械过程尚未得到阐明。因此，本研究旨在探讨PDAC-衍生的外泌体（PEX）用于调节未来转移位点的微环境中使用的特定机制。通过操纵靶分子，我们希望为PDAC肝转移提供新的治疗策略。
二、研究结果
Figure1PEX诱导肝纤维化微环境并促进PDAC肝转移
从小鼠正常胰腺（NPEX）和小鼠PDAC细胞（PANC02和KPC）中分离的外泌体呈现出典型的外泌体结构和大小约为50-nm（图1a，b）。进一步的Western印迹分析证实了孤立外泌体的存在（图1c）。为了确定PEX在PDAC肝转移中的作用，我们首先通过肾包网注射进一步建立了“教育”程序，并进一步建立了PDAC肝转移模型（图1D）。在“教育”程序中，STE和AFM在与NPEX组（图1E，F）相比，PEX组小鼠肝硬化的显着增加（图1E，F）。此外，肝组织胶原蛋白密度增加（图1g），肝脏ECM被重新调整（纤连蛋白，胶原蛋白I和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）上调;当用PEX进行教育时，vitronectin和TenascinC下调）（图1h，i）。类似地，PDAC原位植入模型还证明了原位肿瘤可以增加肝胶原沉积。此外，肝转移模型在PEX组中显示出比NPEX组更高的肝转移和更高的肝脏重量（图1J）。这些数据表明，PEX可以通过重塑肝脏ECM来促进PDAC肝转移来诱导纤维化肝脏微环境。
Figure2PEX增强肝星状细胞（HSC）的活性
确认PEX的生物学功能，用PEX温育初级小鼠肝细胞。然后使用免疫荧光染色表征原发性肝细胞的类型，结果表明，PEX由DESMIN+HSC和F4/80+Kupffer细胞溶出（图2A，在线补充图S4B）。承认HSCs对肝脏ECM重塑很重要，我们研究了PEX对HSCs（在线补充图S4C，D）生物学行为的影响，发现HSC的增殖和迁移能力通过PEX显着加强（图2B和C）。然而，在用PEX与NPEX处理的HSC的凋亡中没有观察到显着差异（图2D）。WESTERBLOT和免疫荧光证明了PEX显着上调的α-SMA表达，表明PEX可以促进HSC激活（图2E和F）。此外，我们观察到PEX通过下调vitronectin和TenascinC的表达，并通过上调胶原I和纤维蛋白的表达（图2g），可以通过下调表达来调节HSC中的ECM分泌。
Figure3胰岛素样生长因子1（IGF-1）信号传导对于PEX诱导的HSC活化和肝纤维化至关重要
进一步探讨通过PEX调节HSC行为的机制，比较了PEX和NPEX基团之间HSC的RNA测序基因表达谱（图3A）。在差异表达的基因中，我们观察到PANC02EXO组对NPEX组和KPCEXO组之间的41个重叠的上调基因的部分交叉点（图3B）。然后通过基因本体学（GO）和基因组（KEGG）途径分析来分析重叠的差异表达基因和KyotoEncodcoia。在细胞组分的术语中，所涉及的主要基因是细胞外空间，细胞外区域和ECM（图3C）;它们与我们的结果一致，表明PEX调节HSC中的ECM分泌。此外，GO和KEGG途径分析表明IGF-1及其下游介导磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）是受PEX影响的全部排序信号通路（图3D，E）。此外，Western印迹分析支持PEX显着增加胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R），胰岛素受体基质1（IRS-1）和HSC中的AKT磷酸化的结果（图3F）。当使用IGF-1R抑制剂时，封闭P-IGF-1R，P-IGS-1和P-AKT的PEX诱导的上调（图3G）。基于这些结果，我们假设IGF-1信号传导可能是调解PEX依赖性HSC激活的关键因素。如预期的那样，IGF-1R抑制剂废除了PEX诱导的HSC活化，增殖和迁移（图4A-D）。此外，IGF-1R抑制剂在HSC中逆转了PEX诱导的ECM生产（图4E）。此外，我们的体内实验表明，PEX教育诱导的肝纤维化被IGF-1R抑制剂（图4F-I）阻断。这些数据表明IGF-1信号传导对于PEX诱导的肝纤维化很重要。
Figure4PEX衍生的CD44V6是必需的，但不足以激活HSC
通过ITRAQ定量蛋白质组学分析，在先前的研究中鉴定了来自PDAC细胞的个蛋白质中的个蛋白。随后，在基因表达综合体数据库中搜索这些蛋白质以找到与IGF-1信号传导的相关性。在这些蛋白质中，CD44变体同种型6（CD44V6）提高了我们的注意。有趣的是，我们以前的研究还揭示了CD44V6参与调节PDAC细胞中的IGF-1途径.19，我们首先验证了外泌体中CD44V6的表达，发现PEX中CD44V6的水平明显高于NPEX（图5A）。研究是否可以将CD44V6递送至受体细胞，使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺测定PEX加法后CD44V6的蛋白质水平。WESTERN印迹分析表明，在加入PEX后，HSCS的CD44V6水平显着增加（图5B），但在添加源自CD44V6敲低（CD44V6-KD）PDAC细胞（在线补充图S5a）中，CD44v6表达仍然存在与NPEX-孵育的细胞相比不变（图5B）。随着靶细胞中介导的蛋白质的位置对于其功能很重要，我们进行了一种免疫荧光测定，其检测与泛钙蛋白分致大致的HSC膜中CD44V6的免疫荧光测定（图5C）。这些结果表明CD44V6可以通过PEX递送至HSC膜。
此外，WB证明CD44V6的敲低或在PEX中使用抗CD44V6抗体强衰减的PEX诱导的IGF-1信号传导的激活（图5D）。同时,在与CD44V6-KDPEX或CD44V6孵育后，PEX诱导的HSC激活（图5E,F）,ECM重塑（图5G）和HSC增殖和迁移的正效应显着降低抗体被阻塞的PEX。为了澄清CD44V6在PEX诱导的HSC激活中的作用，我们进一步研究了HSC中的CD44V6过表达是否具有激活HSC作为PEX的效果。然而，CD44V6的过表达没有按预期增强α-SMA表达（图5H）。这些结果表明CD44V6发挥着重要作用，但不足以用于PEX诱导的HSC激活。
Figure5PEX衍生的CD44V6/C1QBP复合物介导PEX对肝纤维化和PDAC肝转移的积极作用
以前，我们发现IGF-1可以通过将CD44V6/C1QBP复合物的形成与从细胞质与膜的补体C1Q结合蛋白（C1QBP）易位诱导，因此激活IGF-1下游途径。因此，我们很好奇知道C1QBP是否参与PEX-诱导的HSC激活通过CD44V6交互。我们的研究结果表明，PEX中C1QBP的表达明显高于NPEX（图6A）。如图6b所示，PEX-孵育的HSC中的C1QBP表达比在NPEX组中较高。同时，在与PEX处理细胞相比，用C1QBP-KDPEX处理HSC后，C1QBP的蛋白质水平显着降低（图6B）。符合HSC中PEX-转移的CD44V6的位置，在膜中也检测到C1QBP，并用泛肠蛋白分配（图6C）。这些数据表明C1QBP可以通过PEX传送到HSC膜。免疫电解显微照片显示CD44V6和C1QBP在PEX中被共表达（图6D）。在同时过表达CD44V6和C1QBP后，共同IP测定揭示了PEX中CD44V6和C1QBP之间的相互作用（图6E）。此外，通过接近连接（图6F）和免疫荧光测定（图6G），我们鉴定了在PEX-孵育的HSC的膜中CD44V6和C1QBP之间的结合，这进一步证实C1QBP和CD44V6作为复杂单元递送至HSCs。此外，CD44V6-KDPEX处理的HSCs具有相对较低的C1QBP表达。相比之下，与C1QBP-KDPEX温育的HSCs中，CD44V6表达不受影响（图6G）。这些发现表明CD44V6在递送外泌体CD44V6/C1QBP复合物方面是重要的。
类似于CD44V6敲低实验的结果，PEX的C1QBP敲低大大抑制了PEX诱导的IGF-1和α-SMA表达的激活（图6H）。进一步研究了HSC激活是否由CD44V6/C1QBP复合物介导，我们在HSC中进行过表达实验，发现C1QBP过表达没有上调α-SMA表达（图6I）。然而，与激活HSC的PEX一样，CD44V6和C1QBP的同时过表达显着增加了α-SMA表达（图6I）。与我们的体外研究一致，PEX中CD44V6或C1QBP的敲低逆转了PEX诱导的HSC活化，肝僵硬率增加和肝脏ECM重塑的影响（图6J-L）。此外，与PEX中的小鼠相比，肾增生注射肝转移模型（图6M）和PDAC原位移植模型证明了CD44V6-KD或C1QBP-KDPex-注入的小鼠中的肝转移减少团体。这些结果表明，PEX衍生的CD44V6/C1QBP复合体介导PEX对肝纤维化和PDAC肝转移的积极作用。
Figure6PEX衍生的CD44V6和C1QBP的高表达预测PDAC患者的肝转移和差的存活率
为了评估肝脏转移周围肝组织中肝组织中的纤维化ECM微环境，进行免疫组化和蛋白质印迹测定。与体内实验一致，纤连蛋白，胶原蛋白I和α-SMA水平显着增加，下调Vitronectin和TenascinC水平（图7A，B）。接下来，我们调查了例PDAC患者中外泌体CD44V6和C1QBP的预后价值。首先，组织衍生的EV的结果证明了PDAC组织中外渗CD44V6和C1QBP的显着高于在正常胰腺组织中（图7C）。此外，外泌体CD44V6和C1QBP在PDAC肝转移患者中表达显着高于没有肝转移的患者（图7C）。免疫电解显微照片显示CD44V6和C1QBP在PDAC组织衍生的EV中共用（图7D）。根据外泌体CD44V6和C1QBP在PDAC组织中的表达（在线补充图S10B）中的表达分为四组（CD44V6和C1QBP低表达），B组（CD44V6低表达和C1QBP高表达），组C（CD44V6高表达和C1QBP低表达）和组D（CD44V6和C1QBP高表达）。进一步探讨了EV-衍生的CD44V6和C1QBP对肝脏转移的影响，我们追踪了前述名没有肝转移的患者术后1年的患者。其中，在30名患者中检测到肝转移（A，5/58组;B组，3/18组;C组，3/15组，第族，第19/31组），以及PEX中高CD44V6和C1QBP表达（D组）的患者更可能发展肝转移，而不是其他患者（P0.）（图7E）。此外，存活分析表明，在EVS中CD44V6和C1QBP高表达的患者显着越差（图7F）。循环外泌体的跟随数据也表现出一致的结果。循环外泌体CD44V6和C1QBP在PDAC患者中的表达明显高于健康对照（图7G），并且PDAC患者肝转移患者循环外泌体CD44V6和C1QBP的表达显着高于在没有转移的那些中的肝转移患者（图7G）。免疫电解显微照片显示CD44V6和C1QBP在PDAC患者的循环外瘤中进行了共表达（图7H）。类似地，根据循环外泌体CD44V6和C1QBP的表达，将PDAC患者分成四组（组，B，C和D）。与组织衍生的EV的结果一致，CD44V6和C1QBP高循环外泌体表达的患者比其他患者更容易发生肝转移（A，5/44组;B组，3/24组;C组，4/26;D，18/28，P0.）在1年的后续期间（图7i）。然而，循环外泌体CD44V6和C1QBP（D组）高表达的患者显着越差，生存结果差（图7J）。总体而言，我们的研究结果证实，组织衍生的EV的CD44V6和C1QBP表达可以预测PDAC患者的预后和肝转移。
三、总结与思考
作者通过PDAC-衍生的外泌体揭示了初级PDAC细胞和HSC之间的远处细胞间通信。此外，PEX通过促进纤维化肝脏微环境的形成来规定肝细胞特异性转移。更基本上，通过向HSC的质膜递送到血浆膜来展示HSC活化和肝纤维化的细化机制，从而诱导IGF-1信号传导的激活。外泌体CDV6和C1QBP可能是有前途的生物标志物，用于预测PDAC患者的预后和治疗PDAC肝转移的潜在靶标。
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策划/殷佩浩
审校/殷佩浩
翻译/汪玉倩
责任编辑/汪玉倩
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