背景
肝单核细胞衍生巨噬细胞（MoMFs）的募集诱导非酒精性脂肪性肝炎的炎症反应。然而，尚不清楚肝细胞的脂*性如何促进MoMF炎症。在这里，作者证明脂*性肝细胞源性细胞外囊泡（LPC-EVs）富含活性整合素β1（ITGβ1），可促进鼠NASH中单核细胞的黏附和肝脏炎症。
结果
1.来源于有脂*性肝细胞的细胞外囊泡（EVs）富含整合蛋白
作者采用一种无偏倚方法来鉴定和表征来自有脂*性肝细胞的EVs中的关键蛋白。蛋白质组学数据的无偏倚独创性通路分析(IPA)确定了ITG信号在最具代表性的典型通路中，尤其是与溶剂处理肝细胞的EVs相比，溶血卵磷脂（LPC）处理的EVs更甚（Fig1A）。Westernblot鉴定出脂*性PMH释放的EVs中的ITGβ1、ITGα5、ITGα9和ITGαv选择性富集，细胞水平无变化（Fig1B），人类肝癌细胞系Huh7获得了相似的结果（Fig1C）。因ITGβ1在肝细胞中是最主要的ITG，以及在MS数据中唯一在EVs中表达的ITGβ亚单位，作者认为ITGβ1是脂*性EVs中ITG最主要的成员。Talin-1（一种与粘附有关的通用itgb1亲和调节剂）蛋白表达水平也在脂*性EVs中增加，暗示ITGβ1在脂*性EVs中处于活性构象。为确认这种观察，作者采用免疫胶体金电子显微镜，并证明使用活性构象敏感的ITGβ1抗体(9EG7)在脂*性PMH释放的EVs中富集ITGβ1(Fig1D)。与溶剂组处理的PMH相比，LPC处理的PMH释放更多活化ITGβ1阳性的EVs（Fig1F）。这些发现在Huh7细胞上也得到了证实（Fig1G）。有趣的是，NASH患者血清EVS中ITGb1的表达增加（Fig1H）。这些数据表明，活性构象的ITGβ1被选择性地分到脂*性肝细胞释放的EVs中。
Fig1（A）通过IPA对来自溶剂或LPC处理的PMH的EVs蛋白质组数据确定的典型途径；免疫印迹分析显示整合素家族成员和Talin-1在(B)PMHs或(C)Huh7细胞的EVs和WCL上的蛋白水平；（D）纳米级流式细胞术显示EVs上活性ITGβ1的表达水平；用Veh或LPC处理的PMH的ITGβ1+EV，(F)PMH和(G)Huh7的ITGb1阳性EV定量；（H）单纯性脂肪变性患者血清中ITGβ1+EVs的定量检测
2.肝细胞脂*化诱导ITGβ1活化和细胞内转运
作者进一步研究了脂*应激下肝细胞中ITGβ1的激活和内向转运（Fig2A），为了确定肝细胞ITGβ1是否被脂*性处理激活，Veh或LPC处理的Huh7细胞的裂解物用无活性(MAB13)或活性(9EG7)构象特异性ITGβ1抗体进行免疫沉淀，并用总ITGβ1的抗体进行免疫印迹分析（Fig2B）。接着作者研究了p38是否介导了LPC诱导的肝细胞ITGβ1激活。LPC处理导致失活显著减少以及ITGβ1活性增加，在p38抑制剂SB存在的情况下，ITGβ1活性降低，表明脂*应激诱导的肝细胞ITGβ1激活是通过p38介导的途径发生的，小鼠肝细胞系AML12也得到了类似的结果（Fig2C）。此外，我们利用免疫荧光显微镜证实了LPC处理诱导了ITGβ1的激活，这种激活被SB抑制（Fig2D）。为了进一步探讨活性ITGβ1在细胞内的转运，作者检测了活性ITGβ1与早期内体标记物抗原（EEA）1，MVB标志物CD63和晚期内标记物Rab7的共同区域化，ITGβ1与EEA1、CD63或Rab7(Fig2E)的共同定位随着LPC的增加而增加。综上所述，这些结果表明肝细胞脂*处理诱导ITGβ1活化和细胞内转运，导致EVs释放活性ITGβ1。
Fig2（A）ITGβ1激活和胞内转运的示意图；（B）Huh7细胞和(C)AML12细胞分别用Veh或LPC加P38抑制剂SB处理；（D）活性ITGβ1用9EG7标记；（E）分别使用抗EEA1、抗Rab7和抗CD63抗体评估活性ITGβ1与早期内体、晚期内体或MVB的共定位
3.来源于有脂*性肝细胞的EVs通过依赖于ITGβ1机制促进单核细胞与LSECs的黏附
RNAseq数据的IPA显示，在LPC-EVs刺激的单核细胞中，白细胞粘附和尿嘧啶相关信号在最多的过度表达的典型通路中，提示LPC-EVs参与单核细胞粘附LSECs（Fig3A）。将人类单核细胞系THP1与来自相同数量的肝细胞的EV进行共培养，无论是用Veh还是LPC处理，EVs用Dio标记（Fig3B）。在THP1细胞表面和较深的焦平面（细胞内）上均观察到EVs（Fig3C），这表明，富含ITGb1的EV与单核细胞在一种拓扑结构上相互作用，这使得它们能够潜在地将单核细胞拴在LSECs上。LPC-EVS刺激的单核细胞与LSECs的粘附性增强（Fig3D）。利用shRNA技术将Huh7上的ITGβ1基因敲除，显示脂*性EVs上的ITGβ1会诱导单核细胞对LSECs的黏附（Fig3E-3F）。总之，这些结果支持LPC-EVITGα9β1通过ITGα9β1-VCAM-1结合在单核细胞粘附于LSECs中发挥作用。
Fig3（A）上图代表了用LPC-EVs与Veh-EVs刺激的单核细胞中的典型通路；（B）用Veh或LPC处理相同数量的Huh7细胞，EVs用DIO标记；（C）THP1与DiO标记的EVs在LPC处理的Huh7细胞孵育的Z堆栈共聚焦显微镜（白色箭头）；（D）用来自PMH±ITGβ1Ab的Veh-EV或LPC-EV刺激原代小鼠单核细胞，然后注入包被单层原代小鼠LSECs的微流室，对贴壁细胞进行定量；（E）免疫印迹分析显示ITGβ1基因在shITGβ1细胞系中被敲除；（F）用来自野生型(WT)Huh7细胞或shITGβ1Huh7细胞的Veh-EV或LPC-EV刺激THP1细胞，并输注到包被单层原代人LSEC±VCAM-1Ab的微流控室中
4.抗ITGβ1抗体处理不会改变FFC饲料喂食小鼠的代谢表型或脂肪变性
综合实验动物监测系统研究显示，每日总热量摄入、体力活动、能量消耗和呼吸商（Fig4A）在FFC喂养的ITGβ1Ab处理和对照IgG处理的小鼠中相似。整个研究期间的体重（Fig4B）、肝脏重量、肝脏与体重比（Fig4C）处死时与FFC饲料显著增加，但ITGβ1Ab处理组和对照IgG处理组之间相似（Fig4D）。肝组织中的甘油三酯含量（Fig4E）随FFC饲料增加而增加，但接受FFC饲料的2个处理组之间无差异。根据HE染色显示，不同处理组喂食FFC的小鼠的脂肪变性程度相似(Fig4F)。总的来说，ITGβ1Ab治疗在FFC喂养的小鼠中耐受性良好，不影响代谢表型或肝脏脂肪变性。
Fig4小鼠（A）体力活动，（B）体重曲线，（C）处死时的肝脏/体重比；（D）23周时的胰岛素抵抗指数；（E）甘油三酯含量；（F）肝组织HE染色的代表性图像
5.喂食FFC的小鼠中进行抗ITGβ1抗体治疗可减轻肝脏炎症
肝组织免疫染色显示，经ITGβ1处理的小鼠的Mac-2阳性面积减少，Mac-2是吞噬活性巨噬细胞的标志（Fig5A-5B）。肝脏巨噬细胞标志物CD68、浸润性炎性单核细胞标志物CCR2、促炎性细胞因子TNF-a、IL12b的mRNA表达下降支持了这一发现（Fig5C）。此外，对肝内白细胞(IHL)群体的流式细胞术分析表明，在喂食FFC的小鼠中，CD45+细胞增加，而ITGβ1Ab治疗后没有明显变化（Fig5D）。总之，这些发现表明，阻断ITGβ1可减少肝脏促炎单核细胞浸润和MOF介导的肝脏炎症。
Fig5（A）肝脏切片巨噬细胞半乳糖特异性凝集素(Mac-2)染色的代表性图像；（B）在10个随机的20倍显微镜视野中对MAC-2阳性区域进行量化，并计算每只动物的平均面积；（C）PCR检测肝组织CD68、CCR2和TNF-α的mRNA表达水平；（D）流式分析IHL群体
6.抗ITGβ1抗体治疗可减轻FFC喂养小鼠的促炎性单核细胞肝脏浸润
为了确定不同亚群的巨噬细胞和其他免疫细胞在NASH的ITGb1Ab保护作用中的作用，作者使用最先进的技术质量CyTOF对B淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、树突状细胞和中性粒细胞以及单核细胞和巨噬细胞进行了分析。根据24种（Fig2A）不同细胞表面标记物的强度，获得了28个细胞簇（Fig6B），每组小鼠表现出簇丰度的特征模式（Fig6C-6D）。在CyTOF获得的28个簇中，有13个簇在研究组之间有差异表达，特别是第5和9簇，具有浸润性促炎因子的典型表达标志，这些簇的丰度随着FFC饲料的增加而增加，但在ITGβ1Ab处理后显著减少（Fig7A）。同样，被定义为浸润性MoMFs的第7和17簇(Fig7B)在FFC喂养的ITGβ1Ab处理的小鼠中减少。在FFC喂养的小鼠中，簇1和簇2的丰度降低，但随着ITGb1的阻断，簇1和簇2的丰度显著增加（Fig7C）。这些簇在FFC喂养的实验组之间没有显示出统计学上的显著差异，表明在FFC饮食诱导的NASH中ITGβ1阻断的保护作用主要是通过减少促炎性单核细胞运输和在肝脏中的滞留而对其他免疫细胞没有显著影响
Fig6（A）28个独特的IHL簇由24细胞表面标记板使用Rphenograph聚类算法定义，在tSNE图上可视化；（B）热图显示了聚类分析中使用的细胞表面标记物的分布和相对强度；（C）热图显示每只鼠标每个簇的相对丰度；（D）各组的代表性tSNE图
Fig7（A）簇5和簇9代表浸润的促炎性MoMF；（B）簇7和17代表浸润的MoMF；（C）簇1、2和28代表修复性巨噬细胞，(D)簇10代表肝巨噬细胞
7.抗ITGβ1抗体治疗减少小鼠NASH中FFC饮食诱导的肝损伤和纤维化
与接受IgG处理的对照小鼠相比，喂食FFC的ITGβ1Ab处理小鼠对肝细胞凋亡具有相对保护作用，表现为TUNEL阳性细胞（Fig8A）和血清丙氨酸氨基转移酶水平（Fig8B）减少以及NAFLD活动度评分（Fig8C）降低。作者检测了纤维化相关基因的表达，在喂食FFC的小鼠中胶原蛋白1a1(Col1a1)和骨桥蛋白(Spp1)的mRNA水平均升高，并且随着ITGβ1Ab的处理而显著降低（Fig8D），表明ITGβ1Ab可能的抗纤维化作用。天狼星红染色（Fig8E）以及α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)免疫组织化学（Fig8F）进一步证实了这一发现。综上所述，这些发现表明ITGβ1Ab对饮食诱导的NASH中NASH相关的肝损伤和纤维化有保护作用。
Fig8（A）肝切片TUNEL染色典型图像；（B）血清ALT含量；（C）NAS分数；（D）肝脏胶原1a1和骨桥蛋白mRNA的表达；（F）肝脏切片a-SMA染色的代表性图像
结论
ITGβ1作为胞外囊泡从脂*应激下的肝细胞中释放出来，介导单核细胞与肝窦内皮细胞的粘附，是肝脏炎症的重要环节。在NASH小鼠模型中，阻断ITGβ1可以减少肝脏炎症、损伤和纤维化。因此，抑制ITGβ1可能成为NASH的一种新的治疗策略。
撰文：刘珂安琪
排版：刘珂安琪
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