导言
从非增殖状态到增殖状态，或反过来，从增殖状态到非增殖状态，包括表达谱在内的细胞的各种组学变化极其显著。其中，原代人肝细胞（PHH）在体外培养后的短时间内，即从分裂静止静默转变向活跃增殖的状态，使得包括NTCP、HNF4a在内的一系列肝细胞特异基因的表达被显著下调，表现不再对HBV感染敏感，支持HBV复制的能力显著下降。因此，理论上讲，任何能影响细胞增殖状态的因素都有可能影响到HBV的感染和复制。而这些因素并非直接影响HBV的感染和复制，不宜将之归类为HBV的宿主因子。
最近，CarlaEller等在NatureCommunication（简称NC）发表的研究中，通过对增殖活跃的人肝癌细胞Huh7细胞的全基因组功能获得（Gainoffunction）筛选实验发现，细胞周期蛋白D（CDK4/6）的抑制基因细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子CDKN2C能够促进HBV复制，并将CDKN2C称为HBV的宿主因子。由于在他们的研究中，细胞周期停滞对于CDKN2C增强HBV复制至关重要，让我们怀疑CDKN2C能否以非细胞周期调控的方式影响HBV的感染和复制。
为了重新评估CDKN2C在慢性乙型肝炎（CHB）患者的HBV复制中的作用，我们首先对与NC文同一GSE数据集中的90位CHB患者的数据进行了分析，但却未能够观察到CDKN2C表达水平在HBVDNA载量10?IU/mL的患者和≥10?IU/mL的患者有显著差异（图1A）。为了验证上述结果，我们又分析了另外一个包含了例HBV相关肝纤维化患者的肝转录组数据集（GSE），同样未观察到肝CDKN2C表达水平与血清HBV基因表达水平之间的相关性（r=0.，P=0.）（图1B）。接下来，我们分析了第三个数据集GSE，该数据集来自21例HBV感染相关的肝细胞癌（HCC）患者的RNA-seq数据，结果显示CDKN2C的表达与恶性肝细胞癌组织中的HBVRNA水平也无相关性（r=0.，P=0.）（图1C）。
图1：CDKN2C不是乙肝病*的宿主因子。
A，在GSE数据集中，血清HBVDNA10?IU/mL和≥10?IU/mL的CHB患者肝脏CDKN2C的表达水平。B，在GSE数据集中，HBV相关肝纤维化患者的肝CDKN2C表达水平与血清HBVDNA的关系。C，GSE数据集中HCC组织中CDKN2C表达水平（FPKM）与肝脏HBVRNA水平之间的相关性。D，GSE数据集中肝细胞增殖指数与Ki-67表达之间的相关性。E，在GSE数据集中比较不同血清ALT水平的慢性乙型肝炎患者肝细胞增殖指数。F＆G，在GSE数据集中肝细胞增殖指数与HNF4α和CDKN2C表达之间的相关性。H＆I，在GSE数据集中，肝脏CDKN2C水平与HNF4α和NTCP表达水平之间的相关性。J＆K，小鼠尾静脉水动力注射后不同时间点的血清HBsAg和HBeAg水平。L，细胞周期相关基因与HBV依赖宿主基因之间的表达相关性分析。蓝色圆点代表细胞周期基因，粉红色圆点代表HBV依赖性宿主基因。两点之间的线表示两个基因的表达水平高度相关，截断值为
r
0.4且fdr0.05。
据报道，当细胞在G1/S转换时CDKN2C的表达显着上调，并能发挥阻滞细胞周期的作用。也有文献报道，CDKN2C表达水平与脂肪细胞的终末分化相关（MorrisonandFarmer）。考虑到HBV复制显著受感染肝细胞的生长增殖状态影响，CHB患者CDKN2C表达水平与肝细胞增殖状态之间的关系值得探讨。我们首先选取了KEGG数据库注释的个细胞周期相关基因中被GSE检测的92个基因，并通过因子分析建立了细胞增殖指数模型。这个新的指数可以较好的反映肝细胞的增殖状态，因为它与这些CHB患者肝组织中的Ki-67水平呈正相关（r=0.，P0.）（图1D）。有趣的是，血清ALT水平较高的患者的细胞增殖指数显著高于ALT正常的患者（UNL，40IU/mL）（图1E），表明坏死性炎症损伤导致肝细胞代偿性增殖。正如预期的那样，细胞增殖指数得分与HBV依赖的宿主基因HNF4α呈显着负相关（r=-6.，P0.）（图1F），这与先前的报道一致。然而，与Eller等人的报告相反，我们发现CDKN2C的表达与源自CHB的肝组织标本中的细胞增殖指数显着正相关（r=0.，P0.）（图1G）。如上所述，作为CDK4/6的抑制分子，CDKN2C可以阻止细胞周期从G1期向S期转换。基于CHB患者肝组织中CDKN2C的表达与增殖指数呈正相关这一事实，我们有理由推断CDKN2C的表达水平的升高只是对肝实质细胞从静止到快速增殖转变的次级反应，试图履行其对CHB患者肝细胞增殖的“制动”功能。
由于数项研究报道了细胞增殖对HBV复制的抑制作用，因此我们在GSE数据集CHB患者中研究了CDKN2C表达水平与一系列已知的HBV相关的宿主因子基因表达之间的相关性。Eller等人的报道，在肿瘤细胞中CDKN2C的表达可通过上调HNF4α，HLF和PPARα等一系列已知可增强HBV转录的与HBV相关的宿主因子基因，来增强HBVRNA转录。与之相反的是，我们发现CDKN2C的mRNA水平与HNF4α（r=-0.，P0.），NTCP（r=-0.，P=0.）（图1H，1I），HLF（r=-0.，P＝0.）和PPARα（r＝-0.，P＜0.）均呈负相关（补充图S1A和补充图S1B）。此外，在HBV感染相关的肝纤维化患者的数据（GSE）中也获得了类似的结果（补充图S1C–S1F）。由于CDKN2C与CHB患者肝组织中HBV依赖基因的表达没有正相关，因此CDKN2C不太可能通过上调这些HBV相关宿主因子基因来增强HBV复制。因为大多数肝细胞处于静止（G0）状态，所以我们认为CDKN2C不太可能在体内抑制细胞增殖从而促进HBV复制。为了验证该假设，我们通过鼠尾静脉水压动力注射（HI）分别向小鼠中注射了HNF4α或CDKN2C表达质粒以及相同量的1.2merHBV质粒，并将载体pcDNA3.1用作对照。在HI后3、6和10天收集小鼠血清，并测量血清中HBeAg和HBsAg的水平。正如预期的那样，HNF4α组的HBeAg和HBsAg水平比对照组高15倍以上，但CDKN2C组与对照组之间无显着差异（图1J，1K）。上述结果表明CDKN2C不能在体内促进HBV复制。此后，我们使用GSE数据集中的数据进一步研究了其他已知细胞周期相关基因与HBV依赖性宿主基因（NTCP，HNF4α，HLF，PPARα，HNF-1，HNF-3，APOBEC3，DDB1，SMC5和SMC6）之间的关系。我们发现几乎所有92个细胞周期基因都与至少一个已知的HBV依赖基因相关（图1L），这表明几乎所有这些细胞周期调节基因都可能影响HBV依赖基因的表达，从而影响HBV复制。
总而言之，我们在这里证明了CDKN2C表达升高与实质肝细胞的增殖状态呈正相关。由于在静止状态下占主导地位的肝细胞中不存在CDKN2C表达，因此在HBV感染患者中CDKN2C表达与HBV复制之间没有相关性。动物实验也证实CDKN2C不能在体内促进HBV复制。将之称为HBV宿主因子是不合适的。
文献来源：
GuanG,ZhengL,XiJ,YangX,ChenX,LuF.CellCycleArrestProteinCDKN2CIsNotanHBVHostFactor.VirolSin.2Jan5.doi:10./s---9.Epubaheadofprint.PMID:.
文字：关贵文
排版：李德瑶
校对：张鹏
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