肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，也是癌症相关死亡的主要原因之一[1]。在慢性炎症和连续性肝纤维化过程中肝细胞的恶化被频繁触发，最终形成肝细胞癌[2]。其中，氧化应激被认为是导致肝损伤发生和发展的相关病理机制[3]。
核因子E2相关因子2（NRF2）/Kelch样相关蛋白1（KEAP1）系统对防止氧化和亲电应激以维持细胞氧化还原稳态至关重要，但NRF2/KEAP1轴在肝癌发生过程中的作用仍存在着争议。近期Heptology的一篇文章“Hepatocyte-specificNRF2activationcontrolsfibrogenesisandcarcinogenesisinsteatohepatitis”中，作者进一步揭示了NRF2/KEAP1轴在肝癌发生中的作用。
研究内容一、慢性肝病患者氧化应激反应增强
作者首先对CLD患者和对照组的人肝标本进行脂质过氧化产物——4-HNE染色。与健康对照组相比，CLD患者的肝细胞呈4-HNE阳性，而胶原和免疫细胞聚集区域未染色(Fig.1A)。pNRF2免疫组化染显示：不同病因的患者，即原发性胆管炎、乙型和丙型病*性肝炎、酒精性肝病的主要肝细胞中pNRF2表达显著增加(Fig.1B)。
此外，对儿童非酒精性脂肪肝病（NAFLD）患者进行RNA测序发现：炎症程度与NRF2活性呈正相关，严重炎症患者明显高于无炎症患者(Fig.1C)。除NRF2活性外，NRF2表达也随着炎症等级的增加而显着增加(Fig.1D)。但脂肪变性等级与NRF2活性或表达均无显着相关性(FIg.1A-B)。而普通NAFLD患者的转录谱显示：NRF2与炎症等级呈正相关(Fig.1E)，但炎症等级对NRF2表达没有显着影响(Fig.1F)。
Fig.1肝细胞特异性NRF2激活控制脂肪性肝炎的纤维化和癌变
二、小鼠脂肪性肝炎遗传模型中的氧化反应
作者采用NEMO?hepa小鼠模型以研究体内的氧化应激反应。NEMO?hepa小鼠的肝细胞和肝非实质细胞均呈4-HNE阳性(Fig.2A)。此外，作者研究了8周龄NEMO?hepa小鼠肝脏中作为主要抗氧化应激反应之一的NRF2依赖性靶基因。RT-qPCR分析(P)H脱氢酶醌1(NQO1)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)、谷胱甘肽S-转移酶M3(Gstm3)以及谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚单位(Gclc)的表达增加(Fig.2B)。这些结果均表明幼年NEMOΔhepa小鼠肝脏中NRF2的活性增加。
Fig.2在脂肪性肝炎的遗传模型中，氧化应激增加与NRF2靶基因激活有关
三、肝细胞KEAP1的特异性缺失可改变NEMOΔhepa小鼠的肝损伤小鼠和人类的数据均显示在慢性肝病（CLD）中NRF2活性增加。因此作者建立了NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa小鼠模型，以评估肝细胞特异性KEAP1缺失和连续性NRF2激活对CLD进展的影响。KEAP1Δhepa和NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa小鼠肝脏与NEMOf/f和NEMOΔhepa小鼠肝脏相比显示出肝体积增大和囊肿形成（Fig.2C），并且肝重比增加（Fig.2D）。然而，血清转氨酶分析显示，与NEMOΔhepa小鼠相比，NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa小鼠的丙氨酸转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶（AP）水平显著降低，而γ-谷氨酰转肽酶（γGT）和谷氨酸脱氢酶（GLDH）水平显著升高（Fig.2D）。RT-qPCR分析表明，NRF2靶基因（如Nqo1、MRP2、Gstm3和Gclc）参与抗氧化应激反应和谷胱甘肽合成。其在KEAP1Δhepa小鼠中，尤其是在NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa小鼠肝脏中表达增强（Fig.2E）。与NEMOf/f小鼠相比，KEAP1Δhepa小鼠的谷胱甘肽-1（GSH）水平略有升高。令人惊讶的是，尽管NRF2靶基因被强烈激活，NEMO?hepa小鼠肝脏的GSH含量却降低了。而肝细胞KEAP1的特异性缺失挽救了NEMO?hepa小鼠肝脏中GSH的消耗（Fig.2E）。HE染色显示KEAP1Δhepa小鼠肝脏的主要变化是胆道系统和细胞死亡灶的数量。而NEMOΔhepa小鼠肝脏则显示出小叶紊乱和严重的弥漫性肝细胞异核症的迹象，这些症状在NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝脏中都有所改善（Fig.2F）。
Fig.3持续激活NRF2可减少NEMOΔhepa小鼠的细胞凋亡和DNA损伤。
为了解细胞死亡机制，作者分析了细胞死亡的不同模式，即坏死、自噬和凋亡。免疫印迹分析显示NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝之间的RIP1和RIP3表达没有差异（图3A）。此外，针对自噬相关基因（如ATG7，LC3，Beclin1和ULK2）的RT-qPCR排除了自噬的参与（Fig.3B）。相比之下，Caspase3染色和Caspase3活性分析表明，与NEMOΔhepa肝脏相比，NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝细胞凋亡明显减少(Fig.3A-B)。
氧化应激通过诱导DNA损伤而启动细胞凋亡[4]。由于NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa表现出抗氧化GSH的显著增加以及凋亡的减少，作者研究了DNA损伤的标志物。pH2AX免疫荧光染色和免疫印迹分析显示，与NEMOΔhepa肝相比，NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝的DNA损伤显著减少(Fig.3C-D)。此外，参与DNA复制、修复和重组的酶RAD51在NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa中也显著减少(Fig.3D)。
四、促炎性巨噬细胞和中性粒细胞浸入NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa小鼠的肝脏中尽管NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa与NEMOΔhepa肝脏相比，细胞凋亡和DNA损伤减少，但通过对每个肝脏的CD45+细胞进行FACS分析显示：其肝脏拥有更多的浸润性免疫细胞，并且NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝脏中存在以CD11b表达为特征的髓系细胞(Fig.3E)。进一步分析发现，NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝中促炎性巨噬细胞（CD45+/CD11b+/GR1.1high）和中性粒细胞（CD45+/CD11b+/Ly6G+）显着增加(Fig.3)。同时，与NEMOΔhepa肝相比，NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝的CCL2表达增加，但CCL5表达却没有升高（Fig.3E）。与这些数据一致的是，NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝脏中IL-1β表达显着上调(Fig.3F)。
总之，NEMOΔhepa小鼠肝细胞KEAP1的特异性缺失不仅减少了凋亡细胞死亡和DNA损伤，而且对炎症环境有强烈的影响。
五、NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝细胞对肝损伤的抵抗力更强。
KEAP1Δhepa肝的原代肝细胞显示出约90%的最高存活率，而NEMOf/f肝细胞的存活率为80%。值得注意的是，NEMOΔhepa肝细胞的细胞活力降低（约60%）可通过额外的KEAP1缺失得到挽救（约85%）（Fig.4A）。同时，与NEMOf/f、KEAP1Δhepa和NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝细胞相比，NEMOΔhepa肝细胞表现出活性氧物的显著增加（Fig.4A）。
对NEMOf/f和KEAP1Δhepa原代肝细胞上清液中的肝损伤标记物（ALT和GLDH）的分析仅显示轻微的细胞损伤（Fig.4B）。相反，NEMOΔhepa肝细胞上清液中ALT和GLDH水平明显升高。KEAP1缺失显著挽救了NEMOΔhepa原代肝细胞的损伤。此外，与NEMOΔhepa肝细胞相比，NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝细胞显示出更少的DNA损伤（Fig.4C），表明肝细胞中NRF2激活保护原代肝细胞免受NEMOΔhepa介导的DNA损伤。用不同浓度的丁基羟基茴香醚（BHA）处理原代NEMOf/f和NEMOΔhepa肝细胞显示出：以剂量依赖性方式降低NEMOΔhepa原代肝细胞上清液中GLDH水平以及DNA损伤。
由于NEMOΔhepa原代肝细胞易受TNFα诱导的凋亡的影响[5]。用TNFα处理后，在NEMOΔhepa肝细胞中检测到pH2AX阳性细胞的增加，而NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝细胞在TNFα处理后没有显示更多的DNA损伤（Fig.4D）。
与NEMOf/f相比，在KEAP1Δhepa肝细胞中，参与谷胱甘肽代谢和外源性物质代谢的基因以及ABC转运蛋白基因显著上调（Fig.4E-f）。同样，一些基因如S-谷胱甘肽转移酶α2（Gsta2）、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚单位（Gclc）、羰基还原酶[NADPH]3（Cbr3）和谷胱甘肽过氧化物酶2（Gpx2）在NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa原代肝细胞中也同样上调（Fig.4F）。
KEAP1缺失可通过上调谷胱甘肽代谢和外源代谢相关基因以及ABC转运体基因，以保护NEMOΔhepa肝细胞免受氧化应激介导的DNA损伤。
FIg.4NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa小鼠的原代肝细胞避免了氧化应激和DNA损伤。
六、NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝细胞在体内外对细胞周期进程的影响。微阵列分析揭示了NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa和NEMOΔhepa肝细胞在体外和体内控制细胞周期进程的基因表达存在显著差异。在NEMOΔhepa肝脏和原代肝细胞中，观察到参与细胞周期和细胞分裂的基因显著上调(Fig.5A-B)。与NEMOΔhepa样品相比，NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa原代肝细胞中参与细胞周期调控的基因显著减少。这些细胞周期进程正调控子（细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白D1和pAKT）的改变可在蛋白质水平上进一步得到验证(Fig.5C)。更具体地说，NEMOΔhepa肝脏中的肝细胞增殖程度更高，而NPC细胞是NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝脏中的主要增殖细胞（Fig.5E)。Ki-67和CK19、F4/80或Ly6G的双重染色显示，在NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝脏中，CK19阳性胆管细胞是主要增殖的NPC组分(Fig.5F)。因此，与NEMOΔhepa相反，NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝显示胆道谱系细胞增殖，而肝细胞免受代偿性增殖。
Fig.5KEAP1缺乏影响体外和体内肝细胞的细胞周期活化。
七、NRF2的持续激活可挽救NEMOΔhepa肝纤维化和HCC的发展。
永久性肝损伤导致持续的肝细胞死亡和代偿性增生，伴随着炎症反应触发HSC激活和细胞外基质生成[6]。与对照组NEMOf/f小鼠相比，13周龄NEMOΔhepa小鼠肝脏中的胶原IA1和αSMA染色显示出明显的纤维化迹象。这种肝纤维化表型在肝细胞KEAP1缺失后显著降低（Fig.6A）。到1周年时，NEMOΔhepa小鼠全都发生明显的HCC（Fig.6D-E）。相反，出现肉眼可见的HCC仅占52周大的NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa小鼠的60%（Fig.6E）。此外，NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝脏之间的肿瘤数量以及大小存在显著差异（Fig.6E）。同样，与NEMOΔhepa小鼠相比，NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa小鼠的肝损伤标记物（如ALT和AP）显著降低（Fig.6F）。与NEMOΔhepa相比，NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa中HCC相关基因（如survivin,HSP70,TGFβ,α-Fetoprotein和epiregulin）表达轻微下调（Fig.6G）。
总之，在NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa肝脏中，氧化应激反应减弱，DNA损伤和肝细胞增殖减少，最终减缓纤维化和HCC的发生。
Fig.6在NEMOΔhepa/KEAP1Δhepa小鼠中，纤维化和HCC发育减弱。
全文总结NRF2在慢性肝病中的激活通过改善肝纤维化、肝细胞癌变的发生和发展具有保护作用。KEAP1的缺失可诱导NRF2靶基因参与谷胱甘肽代谢和外源性应激。NEMO?hepa肝脏中的谷胱甘肽（GSH）的缺乏症可在KEAP1特异性缺失后得到补救。因此，与NEMO?hepa肝相比，NEMO?hepa/KEAP1?hepa肝显示出细胞凋亡减少以及参与细胞周期调节和DNA复制的基因显著下调，并且其肝纤维生成减少，肿瘤发生率降低，肿瘤数量减少以及肿瘤大小减小。该文章进一步解释了NRF2/KEAP1轴在肝癌发生过程中的作用，并指出NRF2活化可能是抑制炎症引发的肝癌发生的有益策略。为防治肝纤维化和肝细胞癌提供了新方向。
参考文献：
[1]AkinyemijuT,AberaS,AhmedM,AlamN,AlemayohuMA,AllenC,etal.TheBurdenofPrimaryLiverCancerandUnderlyingEtiologiesFromtoattheGlobal,Regional,andNationalLevel:ResultsFromtheGlobalBurdenofDiseaseStudy.JAMAoncology;3:-.
[2]El-SeragHB,RudolphKL.Hepatocellularcarcinoma:epidemiologyandmolecularcarcinogenesis.Gastroenterology;:-.
[3]Cichoz-LachH,MichalakA.Oxidativestressasacrucialfactorinliverdiseases.WorldJGastroenterol;20:-.
[4]CluttonS.Theimportanceofoxidativestressinapoptosis.BrMedBull;53:.
[5]BerazaN,LüddeT,AssmusU,RoskamsT,VanderBorghtS,TrautweinC.Hepatocyte-specificIKKgamma/NEMOexpressiondeterminesthedegreeofliverinjury.Gastroenterology;:-.
[6]BrennerDA.Molecularpathogenesisofliverfibrosis.TransAmClinClimatolAssoc;:-.
撰写：蔡祖欢
编辑：陈霄阳
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