文章来源
中华肝脏病杂志，.29（3）：-
作者：
瞿欢佳王磊庄振杰杨文君丁建平施*平
DOI:10./cma.j.cn--
摘要
目的
通过蛋氨酸和胆碱缺乏（MCD）饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型探讨磁共振成像（MRI）对肝脏脂肪含量以及铁含量定量测定的准确性。
方法
将60只SD大鼠随机分为实验组（MCD饮食，n=30）和正常对照组（普通饮食，n=30）。分别在2、4、8周末行大鼠专用MRI检查，获得质子密度脂肪分数（PDFF）以及R2*值后处死大鼠，取肝脏组织进行HE染色、普鲁士蓝染色等，火焰原子吸收法测定肝组织匀浆中的非血红素铁（NHI）。据资料不同用ANOVA单因素方差分析、t检验或χ2检验进行统计学分析。
结果
MCD饮食组在2、4、8周的PDFF值（%）分别为23.37±9.20、28.07±6.84、25.40±7.04（P0.01）及R2*值分别为90.58±15.92、.12±13.47、.35±15.76（P0.05），显著高于正常对照组PDFF（2.39±0.50、2.45±0.45、3.26±0.80）以及R2*（48.93±7.90、54.71±5.91、64.25±15.76），且随着疾病进展，R2*逐渐增高，与各组肝组织匀浆中的NHI趋势一致。
结论
MRI作为一种无创性量化手段，可准确评估脂肪性肝病肝脏脂肪和铁的含量，且随着脂肪变严重程度的进展，铁沉积呈加重趋势。
临床上曾认为非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD）是一种相对良性预后的疾病，与肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗、代谢综合征、心血管疾病和肝脏铁超负荷密切相关[1-4]。但是包括非酒精性脂肪性肝炎（NASH）在内的NAFLD患者人数一直在增加。NASH可导致肝硬化和肝细胞癌（HCC），正在成为当今世界上最严重的健康问题之一。大约三分之一的NAFLD患者血清铁蛋白和肝脏铁超负荷升高，称为“铁过载综合征”（DIOS）[5-7]。NAFLD进展的机制以及它是否与DIOS密切相关仍然很不清楚。增加的铁储存可能是NAFLD的致病因素，因为它可能增加肝细胞膨胀、炎症和纤维化的风险，这是NASH肝脏损害的特征，NASH是一种更严重的NAFLD形式[8-10]。因此，早期评估肝脏脂肪和肝铁具有早期发现和早期干预的巨大潜力。肝脏脂肪变和铁沉积的金标准是活组织检查。MRI作为一种非侵入性技术，可用于量化肝脏脂肪和铁的含量，目前已经建立了合适的方法来评估铁超负荷受试者的肝脏铁[11-15]。动物研究非常有用，可用于全面的组织学分级和铁提取[16]，以严格测试和验证NAFLD中铁超负荷和疾病严重程度的关系[17]，包括各种监测指标。与临床研究不同的是，研究者可以自由控制肝脏脂肪变性和铁沉积，能够在动物中获得大量样本，用于在短时间内进行多次重复分析。因此，本研究的目的是使用同时具有脂肪变性和铁超负荷的动物模型，通过MRI检测质子密度脂肪分数（PDFF）和R2*评估肝脂肪变性与肝脏铁超负荷之间的关系。本研究中描述了脂肪变性和铁超负荷的动物模型，MRI检测了肝脏脂肪含量以及铁含量，以火焰原子吸收光谱法测定肝脏非血红素铁（NHI）作为参考。上述内容在其他研究中很少提及。
资料与方法
1.实验动物
无特定病原级SD大鼠来源于上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）-。选取8周龄大鼠，分别予普通饮食、蛋氨酸和胆碱缺乏（MCD）饮食（来源于南通特罗菲饲料科技有限公司，配方：蛋白质17g/kg，碳水化合物66g/kg，脂肪10g/kg）。
2.大鼠分组及标本采集
SD大鼠一共60只，适应性饲养1周后，编号，称重，随机分为以下2组：正常组大鼠予普通饲料喂养（对照组），实验组大鼠予MCD饲料喂养（MCD组）。造模开始后每周观察并记录各组大鼠的摄食量、摄水量、体质量、食欲、行为习惯、大小便等改变，定期测大鼠体质量以及血糖。分别于2、4、8周末，禁食、禁水6h后，3%戊巴比妥钠（0.15ml/g），头低尾高，腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位，行3.0TMRI（GEdiscoveryMR，大鼠专用线圈），分批（每批10只）处死所有大鼠，处死前腔静脉取血，置于1.5ml的EP管中备用，分离整个肝脏，取组织做冰冻切片及石蜡包埋，剩余组织部分保存于冻存管中。
3.大鼠磁共振检查
所有检查均由同一磁共振医师施行，他们对大鼠的病理结果并不知情。采用GEdiscoveryMR3.0T超导型MRI系统、8通道体部相控阵线圈及图像采集系统（大鼠专用线圈）。扫描序列包括T1加权成像（T1-weightedimaging，T1WI）、弥散加权成像（diffusionweightedimaging，DWI）、IDEAL-IQ序列。IDEAL-IQ成像技术主要参数如下：TR11.9ms，TE5.4ms，层厚3.0mm，层间隔0.6mm，小反转角5°，扫描层数16。
4.肝组织病理检测
组织切片脱蜡、脱水、包埋、切片，行油红染色、苏木精-伊红染色（HE染色）以及普鲁士蓝染色后显微镜下观察，均由相同的2位经验丰富的病理医生阅片，评估脂肪变程度、炎症和纤维化分期和分级，诊断不一致时重复阅片以达成共识。肝脂肪变程度分级参照《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(年修订版)》[18]：S0无脂变（5％），S1轻度脂变（5％～33％），S2中度脂变（34%～66%）；S3重度（66％）。肝组织炎症积分依据Knodellhistologicalactivityindex（HAI）分为S0～3期[19]，肝纤维化分期依据Ishaksystems将其分为F0～4期[20]。铁染色分级：高倍镜视野计数铁颗粒数目，取3个铁染色阳性最密集区域，求其平均值，行半定量积分，0～5个铁颗粒记为0分；6～10个铁颗粒记为1分；11～15个铁颗粒记为2分；16～20个铁颗粒记为3分；20个铁颗粒记为4分[21]。
5.肝脏非血红素铁（NHI）的测定
肝脏NHI为每毫克蛋白量中铁含量。取肝脏组织0.1g，加入超纯水制成10%匀浆，离心（r/min），取μl上清液加入到0.6mol/L三氯乙酸混合物，水域（90℃，30min，每10min混匀1次），常温静置冷却，离心（r/min，4℃，5min），取上清液1ml加入至1%硝酸定容至10ml，火焰原子吸收光谱仪直接测定溶液中铁含量。BCA法检测肝脏组织匀浆蛋白浓度。
6.统计学方法
所有结果均采用SPSS21.0软件进行统计学处理，计数资料用率表示，计量资料用xbar±SD表示，三组间均数差异的比较，采用ANOVA单因素方差分析，组间两两比较采用LSD或SNK法(方差齐)和Tamhane或Dunnett法（方差不齐），组与组之间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。P0.05为差异具有统计学意义。
结果
1.大鼠一般情况及生化指标
造模期间各组大鼠生长、发育良好，实验组大鼠随造模时间延长，体质量逐渐下降，毛发短少，甘油三酯、血糖呈下降趋势（与造模方式密切有关），对照组体质量逐渐增加，毛发色泽光。血清学指标见表1。
2.各周期正常组和实验组大鼠病理脂肪变、PDFF、R2*、肝组织NIH比较
在动物组织中，在2、4、8周时发生显著的肝脏脂肪变性，脂肪变快速形成，且均大于60％。如图1，正常饮食和4周时MCD饮食的大鼠的肝脏病理油红染色，MCD大鼠已经具有显著的脂肪变化。3个周期段内正常饮食的大鼠病理脂肪变无明显改变，均小于5%，PDFF值分别为2.39%±0.50%、2.45%±0.45%、3.26%±0.80%。MCD饮食组的大鼠病理结果快速出现脂肪变，但组间差异不明显，分别为78.89%±13.64%、78.75%±11.26%、78.%±16.89%。PDFF与大鼠的病理性脂肪变性高度一致，分别为23.37%±9.20%、28.07%±6.84%、25.40%±7.04%。普鲁士蓝染色，未观察到明显的铁颗粒沉积（图2）。通过MRI在3组大鼠中获得的R2*，MCD组大鼠高于对照组大鼠。随着疾病的进展，R2*逐渐增加。正常饮食组分别为48.93±7.90、54.71±5.91、64.25±7.77，MCD饮食组分别为90.58±15.92、.12±13.47、.53±11.13，P=0.，取肝组织检测肝脏NHI作为肝脏铁含量的评估标准。结果显示随着疾病的进展，NHI逐渐增加，分别为12.18±2.16、14.61±3.21、17.43±5.42，P=0.，显著高于正常饮食组，分别为9.46±1.37、11.39±1.78、10.26±1.57，与R2*趋势一致。见表2，图2～3。
讨论
肝脏是碳水化合物、脂质分解合成代谢、铁稳态的中心器官，几类物质代谢在脂肪性肝病中相互作用和影响。在这项研究中，我们发现通过NAFLD大鼠的肝组织以及MRI结果对比分析，肝内铁与脂肪变性严重程度密切相关。随着脂肪变性逐渐增加，肝脏中的铁含量也增加。
为了研究NAFLD和铁沉积之间的动态变化以及可能存在的联系，我们探索了相关的动物模型。大鼠和人类表现出相似的代谢生理学，使大鼠成为优秀的模型生物，我们估计大鼠和人类之间的脂肪和铁的MRI没有显著差异。然而，对大鼠肝脏的研究具有挑战性，因为它们很小且不规则。课题组建立了专用的大鼠模型铁沉积模型以及大鼠专用磁共振线圈序列。陆美婷等[22]发现MCD饲料模型可快速诱导和建立NASH模型，2周时就能形成明显的脂肪变，并且能检测NAFLD不同阶段的脂肪变、炎症、纤维化的变化。Okada等[23]发现在大鼠MCD饲料喂养至6周或13周时，可观察到肝脏铁含量增加。而陆美婷等[22]将此时间点提前至2周，即发现NHI增高。通过MCD饲料可短期、快速诱导NAFLD模型，虽然病理性普鲁士蓝染色没有明显的铁沉积，但我们使用NHI作为肝组织中铁含量的评估标准，火焰原子吸收光谱法测定铁含量，BCA方法测定组织匀浆蛋白浓度，肝脏NHI含量表示为每毫克蛋白质的铁含量。因此本研究将研究时间截点设计在2、4、8周，主要研究目的是通过该NAFLD的铁沉积模型，观察铁沉积变化规律，建立一个可行的铁沉积状态变化的模型，通过火焰原子吸收光谱法对肝组织中铁浓度的检测作为参考标准，验证磁共振R2*值对铁量化测定的准确性。在我们的研究中，我们观察到MCD饲料可以迅速诱导大鼠的铁超负荷，原因尚不清楚。从发病时间开始，约2周内出现明显的铁超负荷，这也是脂肪肝更明显的时间。随着疾病的进展，NHI呈逐渐增加趋势。脂肪含量以及铁含量检测的金标准是肝活检，是一种有创且重复性差的一种手段，不容易被患者接受，且价格昂贵。MRI是可以广泛应用、无创、敏感的诊断肝脏脂肪含量铁沉积的技术，应用大鼠铁沉积模型以及大鼠专用磁共振线圈序列，进一步验证磁共振R2*值对铁量化测定的准确性。PDFF与大鼠的病理性脂肪变性高度一致，大鼠R2*值及NHI在MCD饮食组和正常饮食组之间有明显差异，且随时间延长呈增高趋势，表明在2、4、8周均有铁的沉积且随着疾病的发展，铁沉积逐渐加重。在2、4周磁共振检测所得的R2*值差异具有统计学意义（P0.05）,但是4周和8周时，增高不是特别明显，可能是大鼠在行磁共振检查时受声音、麻醉程度的影响，或者是医生阅片选择感兴趣区域时选择的点位置引起的误差，但是R2*和NHI总体趋势是一致的。
George等[24]发现MCD模型在喂食后第8周开始出现炎症甚至纤维化，第12周肝纤维化最明显。我们在研究8周结束，炎症和纤维化变化不明显，并未观察到每组中的炎症和纤维化以及R2*和NHI之间的关联。进一步延长研究时间可能能够观察到上述现象。
综上所述，MCD饮食诱导的NAFLD模型也是良好的合并铁沉积的模型，随着脂肪变严重程度的进展，铁沉积呈加重趋势。MRI对脂肪性肝病肝脏脂肪含量以及铁含量有较高诊断价值，相对于目前临床上应用的其他检查手段具有高特异度、高灵敏度等的优势，以达到减少有创性肝活检的目的，易于被患者及临床医师所接受，值得广泛应用。
参考文献
[1]VernonG,BaranovaA,YounossiZM.Systematicreview:the
epidemiologyandnaturalhistoryofnon-alcoholicfattyliverdisease
andnon-alcoholicsteatohepatitisinadults[J].AlimentPharmacol
Ther,,34(3):-.DOI:10./j.-...x.
[2]MarchesiniG,BriziM,BianchiG,etal.Nonalcoholicfattyliver
disease:afeatureofthemetabolicsyndrome[J].Diabetes,,50(8)
/p>
-.DOI:10./diabetes.50.8..
[3]LoombaR,SanyalAJ.TheglobalNAFLDepidemic[J].NatRev
GastroenterolHepatol,,10(11):-.DOI:10./
nrgastro...
[4]AdamsLA,AnsteeQM,TilgH,etal.Non-alcoholicfattyliver
diseaseanditsrelationshipwithcardiovasculardiseaseandother
extrahepaticdiseases[J].Gut,,66(6):-.DOI:10./
gutjnl--.
[5]NelsonJE,KlintworthH,KowdleyKV.Ironmetabolismin
nonalcoholicfattyliverdisease[J].CurrGastroenterolRep,,
14(1)
-16.DOI:10./s---4.
[6]DatzC,MullerE,AignerE.Ironoverloadandnon-alcoholicfatty
liverdisease[J].MinervaEndocrinol,,42(2):-.DOI/p>
10./S1-.16.-7.
[7]DongiovanniP,FracanzaniAL,FargionS,etal.Ironinfattyliver
andinthemetabolicsyndrome:apromisingtherapeutictarget[J].J
Hepatol,,55(4):-.DOI:10./j.jhep..05..
[8]ManousouP,KalambokisG,GrilloF,etal.Serumferritinis
adiscriminantmarkerforbothfibrosisandinflammationin
histologicallyprovennon-alcoholicfattyliverdiseasepatients[J].Liver
Int,,31(5):-.DOI:10./j.-...x.
[9]KowdleyKV,BeltP,WilsonLA,etal.Serumferritinisan
independentpredictorofhistologicseverityandadvancedfibrosisin
patientswithnonalcoholicfattyliverdisease[J].Hepatology,,
55(1):77-85.DOI:10./hep..
[10]FracanzaniAL,ValentiL,BugianesiE,etal.Riskofnonalcoholic
steatohepatitisandfibrosisinpatientswithnonalcoholicfattyliver
diseaseandlowvisceraladiposity[J].JHepatol,,54(6):-
.DOI:10./j.jhep..09..
[11]PietrangeloA.Ironandtheliver[J].LiverInt,,36Suppl1:-
.DOI:10./liv..
[12]HenningerB,ZollerH,KannengiesserS,etal.3Dmultiechodixonfor
theevaluationofhepaticironandfatinaclinicalsetting[J].JMagn
ResonImaging,,46(3):-.DOI:10./jmri..
[13]HernandoD,LevinYS,SirlinCB,etal.Quantificationofliveriron
withMRI:stateoftheartandremainingchallenges[J].JMagnReson
Imaging,,40(5):-.DOI:10./jmri..
[14]HenningerB,ZollerH,RauchS,etal.R2*relaxometryforthe
quantificationofhepaticironoverload:biopsy-basedcalibrationand
